MDSの遺伝子異常-pre-mRNA splicing abnormalities の履歴(No.1)

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- 1 (2022-10-25 (火) 10:29:50)

MDS：pre-mRNAスプライシングに関わる一群の遺伝子の異常†

最近, 全エクソームシークエンス解析により, MDSほか関連する骨髄性腫瘍においてRNAスプライシングに関与する遺伝子が高頻度に変異を来していることが見出された。

1. SF3B1
Papaenmmanuilら*1により, 低リスクMDS症例8例において6例に認められ、その後の多症例解析でMDSの20%に検出された(72/354例). その他の骨髄性腫瘍には, AML(5%), CML(0%), MPNs(12/420:3%)と低頻度であることがわかった。

2. U2AF35, SRSF2, ZRSR2, SF3A1, PRPF40B, およびSF3B1
Yoshida*2らにより種々のサブタイプを含む29例のMDS症例解析から16例にこれらRNAスプライシング装置に関わる複数の遺伝子に変異が検出された。MDS(130/228;57%), CMML(48/88;55%), 二次性AML(16/62;25.8%)。
de novo AML(6.6%), MPNs(9.4%)では相対的に低頻度であった。

3. 変異SRSF2をもつMDSはwild type SRSF2の群に比べoverall survivalが短く、急性白血病への進行をおこす率が高い。*3　

SRSF2は, スプライシング調節因子SRタンパク質のひとつをコードする遺伝子

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RNAスプライシング Splicing†

真核生物の遺伝子タンパク質コード領域は, 通常タンパク質を指令しない介在配列(intervening sequence), すなわちイントロン(intron)により分断されている。
コード領域は, 発現される配列= expressed sequence; エクソンexonと呼ばれる。真核生物遺伝子ではタンパク質を指令するのは遺伝子全体のほんの一部にすぎないことが多い。

本来エクソン, イントロンという言葉は遺伝子DNA上の領域をあらわすが, pre-mRNAやmRNA上でそれに対応する領域もしばしばエクソン, イントロンと呼称する。

これまでに調べられてたmRNAをコードする遺伝子には0から362個のイントロンが含まれていた。tRNAをコードする遺伝子にはイントロンはないか, あっても1つ。rRNAは少数のみがイントロンを有する*4。

イントロンとエクソンはともにRNAに転写される。転写された未成熟なRNA(mRNA前駆体:pre-mRNA)からイントロンを切り出しエクソンどうしをつなげて最終産物を作る過程をRNAスプライシング(RNA splicing)という。前駆体は5'末端と3'末端のプロセッシングやスプライシングを受けて最終のmRNAとよばれるRNAとなる。

スプライシング反応1回につきイントロンが1個除去される。実際にはエステル転移とよばれる反応が2回連続して起こりエクソン2個が連結され, イントロンは投げ縄構造となってのぞかれる。

核内pre-mRNAのスプライシングにおける中間体は分岐していて, あたかもカウボーイの投げ縄(lariat)のように見える

スプライシング第一段階では「投げ縄型中間体」が形成される。イントロンの中ほどにあるアデノシン塩基の2'ヒドロキシ基が, 最初のエクソンとイントロン開始部Gとの間のリン酸ジエステル結合を攻撃し、投げ縄を形成, 同時にイントロンから最初のエクソンを切り離す。

第二段階では最初のエクソン端末に残る3'ヒドロキシ基が二番目のエクソンとイントロン間のリン酸ジエステル結合を攻撃することによりエクソン-エクソンリン酸ジエステル結合が形成され同時に投げ縄状となったイントロンが放出されスプライシングが完成する。

イントロンの構造: スプライシングのおこる位置は塩基配列が指示する。

基本的なpre-mRNA スプライシング(イントロン除去)にはイントロンの3つの部位、5'スプライス部位、3'スプライス部位、およびイントロン中にあって切り取られる投げ縄構造の結び目, 分岐点=ブランチポイントが関わっている。

5'スプライス部位と3'スプライス部位は別名ドナーサイト、アクセプターサイトとも呼ばれ、それぞれイントロンの上端と下端に位置する。ブランチサイトは3'スプライス部位の数十塩基上流にあり、スプライシング反応の第一段階で切断された5'スプライス部位がここのアデノシン残基に結合する。

これら3つの部位は、それぞれ周辺に特徴的なある程度共通した塩基配列を持ち、これをコンセンサス配列という。さらに、酵母と植物以外ではピリミジンに富んだ領域（ポリピリミジントラクト）がブランチサイトの下流、3'スプライス部位の上流にあり、イントロンの認識に重要な役割を果たしている。

核イントロンには3', 5'末端にあるスプライス部位のコンセンサス配列のみでなく, 分岐点共通配列が存在している。その配列は酵母ではほぼ一定のUACUAACである。高等真核生物では、この配列はもっと多様性があり, YNCURACである。すべての場合において, 分岐点にあるヌクレオチドは共通配列の最後のAになる。

エクソン境界にあるスプライシングシグナルとイントロン末端付近にある配列(分岐点配列)の両者があってもエクソンを定義し正確にイントロンを切り出すには十分とはいえない。高等真核生物の多くのイントロンは100Kbをこえるほど巨大で, この中に正常に見える分岐点配列を含むスプライスシグナルによって分断されたエクソンのような配列を多数含むためである。

しかし, 本物のエクソンにはスプライシングを促進するエクソンスプライシングエンハンサー(ESE)とよばれる配列が含まれる傾向にあるためこれらの偽エクソンはスプライシングされ成熟RNAになることはほとんどない。一方偽エクソンにはスプライシングを阻害するエクソンスプライシングサイレンサー(ESS)が含まれる傾向にある。

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スプライソームとスプライシング反応過程†

pre-mRNAのスプライシング装置は非常に複雑で5分子のRNAと50個以上のタンパク質から構成され, 反応のたびに多数のATPを加水分解している。

スプライシングはスプライソソームsplisosomeと呼ばれる粒子上でおこる。哺乳類では沈降係数60Sであり, pre-mRNAの他に多くのRNAやたんぱく質が含まれ, これらのRNAとタンパク質のいくつかは核内低分子リボ核タンパク質(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP[=スナープと読む])を形成している。

snRNPは核内低分子RNA(small nuclear RNA, snRNA)がタンパク質と共有結合したもの。snRNAはすくなくともU1, U2, U3, U4, U5, U6の6種類があり(電気泳動による), U1, U2, U4, U5, U6の5種類のsnRNAはすべてスプライソソームに含まれスプライシングに重要な役割を演じている。

snRNAは真核生物に独特のものでサイズは100-200ヌクレオチド。snRNAに結合するタンパク質は, それぞれのsnRNPに独自のものと共通のものがある。snRNA,タンパク質いずれも真核生物の間でよく保存された構造をもっている。U3snRNAは核小体にあり, 他のものは核質にあってpre-mRNAと結合していることが多い.

snRNAとタンパク質の両者のスプライシング因子がイントロン末端および分岐点にある共通配列すなわちスプライシングシグナルを認識していることが分かっている。スプライソソーム内のこれら両スプライシング因子がスプライシングの始めから終わりまでを指揮している。

ただしスプライス因子のタンパク質には酵素活性はなく, rRNAの場合に見られると同様RNA自身が酵素活性を持っている。

スプライスサイクル Splicecycle(snRNAの動きに注目した解説)*5

１．まず転写されたmRNA前駆体上の5'スプライス部位にU1 snRNP が結合し、U2 snRNP は分岐点に結合する。

２．これらに含まれるU1 snRNAおよびU2 snRNAはpre-mRNAに一部相補的な配列を持ちこれがスプライス部位の認識に関わる。

３．さらにU4U5U6 snRNPが会合し、U1 snRNPはU6 snRNPにその場を譲り乖離する。またU4 snRNPもこの前後に離れるとされる。

４．この状態では、U6 snRNPは分岐点のU2 snRNPと5'スプライス部位に結合しており、U5 snRNPは上流のエクソンに結合している。ここで5'スプライス部位の切断と分岐点への結合が起こる（スプライシング反応第一段階）。このとき、イントロンは投げ縄状の構造になる。別名ラリアット構造とも呼ばれる。

５．U5 snRNPは下流のエクソンにも結合するようになり、両エクソンはU5 snRNPによって繋ぎ止められた状態になる。

６．次に、3’スプライス部位の切断とエクソン同士の結合が起こり、イントロンが放出される（スプライシング反応第二段階）。

７．放出された投げ縄状イントロンは分岐が外され（デブランチング）、分解される。一方、これらのsnRNPは再びスプライシング反応に使用するために再生される。

上記はGT-AG型イントロンの場合であるが、AT-AC型イントロンでは、U1、U2、U4、U6の代わりにU11、U12、U4atac、U6atacというsnRNPが使われる。

U1snRNAとpre-mRNAの5'スプライス部位との間の塩基対形成はスプライシングの必要条件であるが十分条件ではない。

U6snRNPはU6snRNAを介して塩基対を形成することによりイントロン5'末端と結合する。投げ縄型中間体が形成される前にこの結合が起きるがスプライシングの第一段階, 投げ縄型中間体形成の後にその性質が変化するのかもしれない。U6とスプライシング基質との結合はスプライシング過程に必須である。U6はスプライシング進行中にU2とも結合する。

U2snRNAはスプライシング分岐点の保存配列と塩基対を形成する。この塩基対形成はスプライシングに必須な現象である。さらにU2はU6と重要な塩基対を形成し, へリックスIと呼ばれる領域を作ることによりこれらのsnRNPをスプライシングに参加できるようにしている。また, U2の5'末端はU6の3'末端と相互作用し, へリックスIIとよばれる領域を形成する。この過程は哺乳類の重要なスプライシング過程である。

U5snRNAは, あるエクソンの最後のヌクレオチドおよび次のエクソンの最初のヌクレオチドと結合する。これによりスプライシングを進行させるために適当な位置に2つのエクソンを配置しているようである。

U4はU6と塩基対を形成する。U4の役割はスプライシング反応に必要となるまでU6を結合させておくことのようである。U6遺伝子は少なくとも2種類の酵母ではmRNA型イントロンにより分断されている。

MDSで遺伝子変異のみられるスプライシング因子

U1 snRNP複合体(complex)により5'スプライス部位が認識された後に, U2AF35/65ヘテロダイマー, ZRSR2, SRSF1/2からなるタンパク複合体が3'スプライス部位に動員され3'スプライス部位を認識する。

さらに3'スプライス部位ではU2AFヘテロダイマーの小型のサブユニットであるU2AF35がAGヌクレオチドに結合する。一方大きなほうのサブユニットU2AF65はpolypyrimidine鎖を認識する。

SRSF1, SRSF2は1個以上のSerin-Arginine-richドメインをもつSRファミリータンパクに所属する。これらはsplicing enhancer sequence(SES)に結合するほか, SRドメインを介して他のタンパク質と相互作用を行う。

polypyrimidine鎖の5'上流側に分岐点シークエンスがある。この部位では他のスプライシング因子であるSF-1が結合し, U2AFヘテロダイマーや他の複合体と一緒にsplicing E complexを形成している。

いったんsplicing E complexが形成されるとU2 snRNP複合体が分岐点に結合しているSF-1を置換してsplicing A complexを作り出す。SF-1の構成員のひとつがSF3B1である。

MDSで変異のみられるスプライシング因子のほとんどがsplicing A complexに所属している。これらの遺伝子変異は互いに排他的に起こっており,3'スプライシング部位の認識が共通の機能である。

U2AF(U2 auxiliary factor)35/65，SRSF2, ZRSR2, SF3B1, SF3A1

pre-mRNAはsplicingに必須のよく保存された配列をintron, exon内に内臓している。
5'splicing site(SS), 3' splicing site(SS); intronを決定する。
branching site (BS), polypyrimidine tract (PPT), exon splicing enhancer (ESE)

MDSにおけるスプライシング因子遺伝子変異の頻度についての複数の研究をまとめた表。

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スプライシングを調節するタンパク質因子†

PDF:ヒトスプライシング調節タンパク質の構造---> &ref(): File not found: "ヒトスプライシング調節タンパク質.pdf" at page "MDSの遺伝子異常-pre-mRNA splicing abnormalities";

SRタンパク質

セリン・アルギニン(SR)の繰り返し配列が特徴的な一群のRNA結合タンパク質でこれまでにヒトでは12種類が報告されている.

どのタンパク質もN末端に1ないし2個のRNA結合ドメイン(RNA binding domain; RBD= RNA recognition motif; RRMと同義), C末端側にはアルギニン・セリンに富むRSドメインをもつ.*6 *7
RBDはRNAの結合に, SRdomainはタンパク質間相互作用に関与していると考えられている.

一部のSRタンパク質は恒常的スプライシングに必須な因子であると同時に選択的スプライシングの調節にも関与している.

SRタンパク質のもう一つの重要な機能はESEに結合し, スプライシング活性化に関わることである.

SRタンパク質はESEに結合すると, 上流の3'スプライス部位に結合したU2AFと下流の5'スプライス部位に結合したU1snRNPの構成タンパク質と相互作用し, エクソンを挟んだスプライス部位同士の連携を誘導しエクソン認識を促進している.

SRタンパク質は重複した機能が多いものの, 異なったmRNA前駆体のスプライシングを調節しており, さまざまなスプライシングを調節するために多くの種類が存在していると推察されている.

heterogenous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP)

転写後にRNAプロセッシングを受ける前の核内に存在する不均一な長さの一本鎖RNA(hnRNA; heterogenous nuclear RNA)に結合する一群のRNA結合タンパク質の総称. hnRNP A1～Uまでおよそ20種類が知られている.*8

hnRNP中にはさまざまな種類のRNA結合ドメインが見いだされており, hnRNP A/B, C1にはRBD, hnRNP KにはKHドメイン（K homology domain), hnRNP A/B, K, UにはRGGボックス(RGG box)が存在している.

hnRNPタンパク質は, 転写やRNA プロセッシング, RNAの輸送や翻訳調節, およびRNAの安定性といったさまざまな過程に関与している.*8

hnRNP A/Bタンパク質はスプライシングでの役割が最もよく解析されている. エクソン内に存在するESSに結合して, そこを起点にhnRNP A/Bタンパク質がエクソン上に広がり, ESEに結合するSRタンパク質などのスプライシング促進因子の結合を阻止することでスプライシングを抑制する。結果としてしばしばエクソン除外を誘導する*9