MPL and CALR gene mutation in patients with Myeloproliferative neoplasm
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関連ページ---[[MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)]], 関連ページ---[[Essential thrombocythemia]] page名改新. 06Mar 2017 *MPL mutation in patients with MPN [#q20e3e2e] ''MPL：[[myeloproliferative leukemia virus oncogene:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4352]]'' [ Homo sapiens ]~ Gene ID: 4352, Official Symbol: MPL provided by HGNC~ Also known as MPLV; TPOR; C-MPL; ''CD110''; THCYT2~ OMIM http://omim.org/entry/159530 1990年, 異なる系統の骨髄造血細胞を不死化する能力のあるマウス骨髄増殖白血病ウイルスから, がん遺伝子, v-mpl が認められた。1992年にはヒトホモローグの&color(red){''c-mpl''}; がクローン化される。~ シークエンスデータより, c-mplは造血受容体スーパーファミリーの一員と相同性のあるタンパクをエンコードしており, c-mplをアンチセンスオリゴで妨害すると巨核球コロニー形成が障害される。 ''c-mplのリガンドである''&color(blue){''トロンボポイエチン(TPO)''};が1994年にクローン化された。TPOは巨核球と血小板形成の主要な制御因子である。 &color(red){''c-mpl遺伝子がエンコードするタンパク質, トロンボポイエチン受容体[TPOR]''};''(c-MPL(Myeloproliferative leukemia protein）やCD110''などとも呼ばれる) -血小板を産生する巨核球の分化・増殖作用を有するトロンボポエチンの受容体である。-635アミノ酸で, ''膜貫通ドメイン、2つの細胞外サイトカイン受容体ドメイン, 2つの細胞内サイトカイン受容体ボックスモチーフ''から形成される。 -TPO-R 欠損マウスは''重症血小板減少''をきたし, CD110とトロンボポイエチンの巨核球, 血小板形成における重要性が強調される。 -またTPORは、造血幹細胞（赤血球、白血球、巨核球などに分化する骨髄中の幹細胞）の維持への関与も示唆されている。 -この受容体は&color(#e2041b){トロンボポエチンが結合することでダイマーを形成し活性化し、JAK/STATなどのシグナル経路が刺激される, さらに STAT ファミリー, MAPK ファミリー, アダプタータンパクShc, および受容体それ自身のチロシンがリン酸化され, 細胞外部からの信号を細胞の核へ伝達する。}; -なお、c-mpl遺伝子の選択的スプライシングにより、c-MPL-P（wild type）とc-MPL-K（truncated）の二つのアイソフォームが存在する。 **''MPNに認められるMPL gene mutation'' [#kc8879d2] #br #ref(c-mpl.jpg,around,right,90%) 近年, MNPの症例にthrombopoietin receptor(MPL)geneの新たな２つの体細胞変異が報告された。 &color(red){''MPL W515LおよびW515K''};(前者の頻度がより高い)は''膜貫通ドメイン(492-513aa)''ごく近傍にあたり, 受容体のダイマー形成に重要な部分と考えられる。トリプトファンがロイシンあるいはリジンに変換された単アミノ酸変化はJAK V617Fと同様に&color(red){''JAK-STAT経路の構造的活性化をまねくgain-of-function変異となっている''};。¬e{:Pardanani AD, et al., MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood. 2006 Nov 15;108(10):3472-6.};¬e{:Pikman Y, et al., MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006 Jul;3(7):e270.PMID:16834459}; MPL mutation検出のPCR primer ¬e{Xu:Xu W, et al., MPL W515L mutation in Chinese patients with myeloproliferative diseases Leukemia & Lymphoma 2008; 49(5): 955-958}; A) ''5' CCTGCTGCTGCTGAGGT&color(red){''T''};GC 3''' : Allele-specific forward primer 3' endより3番目のG(Tryptophan:wild-type)-->T(W515L):トリプトファンがロイシンに変換。 B) ''5' AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3''': outer, forward primer (intron9に設定。) C) ''5' CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3''': reverse primer (intron 10 ): 5' outer(wild-type)のPCR, AS-PCR両方に使うようです。 94℃ 30sec, 65℃ 30sec, 72℃ 60sec x 35 cycles wild-type 409bp productがouter pairにより形成、mutantは297bpのバンドをあらわす。 文献¬e{:Beer PA. et al., MPL mutations in myeloproliferative disorders: analysis of the PT-1 coort. Blood 2008; 112: 141-9};によれば&color(red){''JAK2 V617F-''};&color(blue){''negative ET''};&color(red){''patientsの8.5%, JAK2 V617F-}; &color(blue){''negative PMF''};&color(red){''の10%にMPL W515の変異が検出されている''};。''PVでは0%であった''。 ''関連ページ'' > [[MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)]] > [[Essential thromobocythemia]] **''JAK2, MPLの異常がみられないMPNにおけるエピジェネティック制御因子異常'' [#u48ac740] &color(blue){''TET2 and ASXL1''}; pathogenic mutations are found'' in 8% of MPN lacking JAK2 and MPL mutations'', whereas IDH1, IDH2, and c-CBL mutations are not detected in this subset of patients.¬e{:Marti'nez-Avile's L, et al., TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Ann Hematol. 2012 Apr;91(4):533-41. doi: 10.1007/s00277-011-1330-0. Epub 2011 Sep 9.}; *CARL exon9 の欠失挿入変異：JAK2, MPL変異のないMPNに認められる遺伝子変異 [#e2906c5f] ''CALR''：[[calreticulin:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/811]]~ also known as: RO; CRT; SSA; cC1qR; HEL-S-99n~ Location: 19q13.3-p13.2, 9 exons~ OMIM myelofibrosis http://omim.org/entry/254450 thrombocythemia 1 http://omim.org/entry/187950 ~ carleticulin(CALR) http://omim.org/entry/109091 #br #ref(CALRmut-ET-PMF.jpg,around,right,80%) ''essential thrombocytemia(ET), myelofibrosis (MF)''ではJAK2変異, MPL変異がおのおの50-60%, 5-10%に認められる。 両方の変異が認められない30-45%の症例には特異な遺伝子異常は検出されていなかった。~ JAK, MPL変異のないMF 6例にwhole exome sequencingを行い全例にcalreticulin(CALR)をコードする''CALR遺伝子のexon9に挿入, 欠失の体細胞変異''を認めた。¬e{Klampfl:Klampfl T. et al, Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasm N Engl J Med 2013; 369(25): 2379-2390 supplement+}; -1107例のMPNを調査。&color(red){''polycytemia vela (PV)にはCALRの変異なし''};. JAK2/MPL変異のないETでは67%, MFでは88％にCALR変異が検出された。 #br -36種類の挿入, 欠失パターンすべてが, 同じ変異reding frameへフレームシフトを起し,&color(#e2041b){''新しいC末端ペプチドをもつmutant calreticulinを産生する''};(右図) -このC-terminusタンパク質をターゲットとする[[''CALR変異タンパク抗体'':http://www.cosmobio.co.jp/product/detail/mutated-calr-antibodies-dnv.asp?entry_id=15895]]が市販されている. #br -CALRの最も多い欠失変異はin vitroで''cytokineに依存しないSTAT5活性化による成長''をうながす。その機序は不明である。--->[[MPLとの関係について下記参照>#f8afaa67]] #br -&color(red){CALR変異症例はJAK2変異症例に比べ血栓症はすくなく長期に生存可能};である。 #br -すべてのCALR変異は&color(red){CALR遺伝子exon9に集中し一様にC末端酸性ドメイン, 多数のカルシウム結合サイトおよびKDELシークエンスのほとんどを消失することになる。この変異はMPNの腫瘍形成初期におこるとされる};¬e{Nangalia:Nangalia J, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2391-405. PMID:24325359};。 #br -マクロファージが介在する免疫回避, 小胞体ストレス反応(unfolded protein reaction:UPR)の活性化, カルシウムシグナルなどにかかわるCALRの役割と腫瘍が関係していると考えられる。 #clear #ref(CALRmutationJPG.jpg,around,right,80%) CALR(calreticulin)は高度に保存された, 多機能な''endoplasmic reticulum(ER)タンパク質''である。ER内ではカルシウム恒常性に不可欠な役割とタンパク質折りたたみに働いている。 ERの外では, 細胞質と膜表面に存在し, インテグリンが仲介する細胞接着, 遺伝子の核輸送, プログラムされた細胞除去, 免疫的細胞死を制御している。 CALRは''特異な機能をもつ３つのドメインより構成される''。&color(red){''N, Pドメイン''};は主として''タンパク質シャペロン機能''に関与している。 >シャペロン（chaperone）とは、他のタンパク質分子が正しい折りたたみ（フォールディング）をして機能を獲得するのを助けるタンパク質の総称。分子シャペロン（molecular chaperone）、タンパク質シャペロンともいう。 一方&color(blue){''Cドメイン''};は主として''endoplasmic reticulum(小胞体)内のカルシウム調節''にかかわっている。 さらにCドメインは&color(red){''KDELタンパクシークエンス''};''を含み, 小胞体からのタンパク質分泌''に関係している。 #clear #ref(MF-PMFmutation01.jpg,around,75%) primary myelofibrosis(PMF), essential thrombosis(ET)のgeneticな異常所見¬e{:Tefferi A, et al: CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia advance online publication 21 January 2014; doi: 10.1038/leu.2014.3}; ¬e{Klampfl:Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al: Somatic mutation of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369:2379-2390a};¬e{Nangalia:Nangalia J,et al: Somatic CALR mutation in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369:2391-2405}; ¬e{:Rumi E,et al: JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood 2014;123 (10):1544-1551}; ¬e{:Rotunno G, et al: Impact of Calreticulin Mutations on Clinical and Hematological Phenotype and Outcome in Essential Thrombocythemia. Blood 2014;123(10):1552-1555}; ¬e{:Lundberg P, et al: Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood 2014; 123(14):2220-2228}; フィラデルフィア染色体陰性のMPN（ETとPMF）で最多の遺伝学的異常はJAK2V617Fで症例の50-60%に検出され診断マーカになる。 MPL遺伝子異常はさらに4-10%のETとPMF症例に認められる。CALRのexon9, 体細胞異常（挿入/欠失）はJAK2V617Fについで二番目に多いET, PMFの遺伝子異常である。JAK2, MPLがwild typeのET, PMFにおいて, 50-90%の例に検出され, &color(red){''重要なことはpolycytemia veraにはCALR遺伝子変異は見つからないこと''};。 と記載したら、calreticulin mutationを示す, JAK2V617F(-), MPL(-)のPVが報告されました。¬e{:Broseus J, et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Oct 10. pii: blood-2014-06-583161. [Epub ahead of print]PMID:25305205}; &color(red){''polycythemia vera(PV)症例の末梢血顆粒球にCALR遺伝子変異 del52bpが認められ, BFU-Eにも同様の変異が検出された''};との報告です。 このようにCALR変異はET, PMFの診断に重要な分子マーカであり, 予後においても重要な因子である。PMFではCALR変異があると良好な予後を示す。''triple-negative (JAK2-, MPL-, CALR-)の症例はhigh-riskケースである。''-->[[triple-negtive ETの新しい遺伝子変異を参照>MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)#c22d5725]] ETにおいては, CALR変異の予後に与える影響はまだ確定していない。しかし, JAK2,MPL変異のケースと比較して, &color(blue){''血栓症のリスクは低い''};とされる。 CALR変異はET,PMFのほかRARS-Tにも低頻度に認められている. (3/24, 12.5%) ¬e{: #clear #br #br #ref(DiagnosisET-PMF.jpg,around,right,80%) ***JAK2V617FのPCRによるスクリーニング [#r67a8e8e] >JAK2V617F allele-specific PCR¬e{:Baxter E et al., Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365 March19: 1054-1061}; --Fsp(allele-specific forward primer):5'AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT 3'--203bp band --Fic(internal control forward primer):5'ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG 3'--364bp internal control band --R(reverse primer): 5'CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA 3' >95℃ Xmin(Hot start Taqの活性化で, Taqにより異なる) >94℃ 30sec~ 58℃ 30sec~ 72℃ 45sec 35cycles >72℃ 5min - 4℃ soak #clear ***MPLW515L変異のPCRによるスクリーニング [#wefe101b] >MPL-W515L allele-specific PCR primer¬e{Xu:Xu W et al., MPL W515L mutation in Chinese patients with myeloproliferative diseases. Leukemia & Lymphoma 2008; 49(5):955-958}; >MPL specific primer(AS-PCR forward primer): 5'CCTGCTGCTGCTGAGGTTGC 3' --MPL intron f primer: 5'AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3' --MPL intron r primer: 5'CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3' >internal control 409bp, mutant band 279bp. 2つのforward primersを加えてPCR. mutantがあれば2本のバンドが出る。 >94℃ 30sec~ 65℃ 30sec~ 72℃ 1 min x 35cycle ***CALR exon9 mutation のPCR, sanger sequencing [#x99194f1] #ref(CALR-protein-structure.jpg,around,right,100%) >CALR exon9 sequencing primer¬e{Nangalia:Nangalia J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2391-405.}; --exon9f: 5'ACAACTTCCTCATCACCAACG 3' --exon9r: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG >''touch down PCR''~ 1. 95℃ X minでTaqを活性化 >2. 94℃ 30 sec, 67℃ 30 sec (-1.0℃/cycle), 72℃ 30 sec x 10cycle >3. 94℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 30 sec x 29 cycle >4. 72℃ 10 min, 4℃ soak >CALR exon9 mutation--> ''high-resolution melting analysisによる同定''の論文¬e{:Bilbao-Sieyro C et al. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations.PLoS One. 2014 Jul 28;9(7):e103511. doi: 10.1371/journal.pone.0103511. eCollection 2014.};¬e{:Lim KH et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clin Chim Acta. 2014 Nov 15;440C:133-139. doi: 10.1016/j.cca.2014.11.011. [Epub ahead of print]}; ***'''CALR'''と'''MPL''' [#f8afaa67] '''''CALR'''''遺伝子変異は50種類以上同定されている.すべての変異がCドメインをコードするC-terminusのexon9の特定の領域に見つかる。&color(#e2041b){変異によってフレームシフトをおこし36個のアミノ酸からなる共通の変異型タンパクを生じる. 変異タンパクではC末端の荷電が陰性から陽性に変化する};。¬e{Klampfl:Klampfl T,et al., Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2379-90.}; #ref(CALR-bind-to-cMPL.jpg,around,right,100%) ''Araki M, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms Blood 2016; 127(10): 1307-1316 Fig.4 A-C'' CALRのNドメインがないとC-MPLへの結合はなくなる。Nドメインだけだとかなり結合する。Pドメインをなくすと非常に結合能が高まる。(CALRはより強くc-MPLへ結合するようになる。). TPOがなくてもautonomous growthがおこるのはfull lengthのIns5のみである。このことから･･･ 1) c-MPLへ変異CALRが結合するにはfull length, すべてのパーツ(ドメイン)が必要である。 2) PドメインはNドメインへのc-MPL結合に抑制的に働いている。野生型のCALRではPドメインの抑制作用によりc-MPLへダイレクトに結合することはほとんどない。 3) 変異CALRでは, あらたにできたC末端側, 陽性荷電チャージ部分がPドメインの抑制作用をさらに抑制している。このためc-MPLとCALRの結合が増強される. CALRはerythropoietin receptorと結合するが(Araki M, et al. supplemental data),活性化できないことから(Araki M, et al. Figure 1D, Chachoua I et al. Figure 1B) PVの原因変異とはなり得ない。 -BloodにCALR変異をもつPVの報告が1例ある¬e{:Broseus J et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Dec 18;124(26):3964-6.};が、これはどうなるのかしらん //--CALR変異はマクロファージによる貪食を回避するようになる。がんでは細胞膜上のCALRが増加しており, CALR mRNAの発現は予後不良と関連している。細胞表面のCALRはpro-phagocytic signalとして機能し, 傷んだ細胞の除去を促進する。細胞表面CALRによるpro-phagocytic機能による細胞除去はantiphagocytic signalであるCD47の過剰発現により抑制されバランスを保っている。((Chao MP, et al. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med. 2010 Dec 22;2(63):63ra94. doi: 10.1126/scitranslmed.3001375.PMID:21178137))((Gardai SJ, et al. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 2005 Oct 21;123(2):321-34.PMID:16239148)) //--MPNでは, CALR変異はER retention sequenceであるKDELを失うことにより, 細胞表面への発現を妨害する。CALR変異をもつ最初のMPN症例では, 細胞質と細胞膜の混在する異常な局在(())が報告されたが, より多くの検討例が必要と考えられる。 //-CALR変異は小胞体ストレス反応(UPR)を妨害し, 競合的な成長が有利になる。ERストレスに応答してUPRは活性化され, ERタンパク質の折りたたみシャペロンを活性化することでタンパク質の翻訳を停止し, 異常な細胞増殖を防いでいると考えられる。 //--UPRの摂動perturbationは, 実際にヒトのがんに関与している(()) //--変異はCALRタンパクのERでのシャペロン機能を害し, 恒常的なUPR応答を妨害することになり細胞の過剰増殖をきたす。 //>perturbation~ //天文学の用語で、ある天体とその母天体（例えば恒星と惑星、または惑星と衛星）の作る系に対し、外部の物体との重力作用によって、その軌道が乱されること。数学，物理学，天文学の問題において，主要部分は正確に解けるが，これに小さい付加項が加わった全体の問題が正確には解けない場合がある。主要部分に付加項による小さい補正が加わったものとみなして，全体の問題を近似的に解く場合に，付加項を摂動といい，その解法を摂動論という. //-変異CALRはJAK2V617Fと同様に, 異常シグナル伝達因子として働き, STATを活性化する。 *** ALL CALR mutationに対する抗体 [#cc3f4153] 川崎医科大学 藤原英世先生からご教示いただきました(2019/3月). (注; この抗体をお勧めしているわけではありません. また, research use onlyです.) ''dianova社 Mouse monoclonal antibody(CAL2) Against All CALRETICULIN(CALR) Mutations''~ 変異CALR C-neoterminusへの抗体. -川崎医科大学附属病院での検討では、希釈倍率20倍、pH6で20分の熱賦活. (Leica Bond Ⅲ)。 -希釈倍率が高くないため, すぐに抗体を消費してしまう. -巨核球の細胞質および一部の顆粒球の細胞質のみ、しかも変異症例に限ってしか 陽性にならない -controlでの評価がなかなかできないのが問題点. 過去に出ている論文でも、その点については言及されていないようです。 -ごく少数ですが、偽陰性症例あり. (順天堂大の荒木先生が自験例でいくつかあったと、2017年の血液学会で言及されていた. -実際に所見を記載する場合、藤原先生は, &color(crimson){''陽性であった場合のみ変異の可能性が示唆される''};という文言を入れるようにされている.
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Blood. 2006 Nov 15;108(10):3472-6.};¬e{:Pikman Y, et al., MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006 Jul;3(7):e270.PMID:16834459}; MPL mutation検出のPCR primer ¬e{Xu:Xu W, et al., MPL W515L mutation in Chinese patients with myeloproliferative diseases Leukemia & Lymphoma 2008; 49(5): 955-958}; A) ''5' CCTGCTGCTGCTGAGGT&color(red){''T''};GC 3''' : Allele-specific forward primer 3' endより3番目のG(Tryptophan:wild-type)-->T(W515L):トリプトファンがロイシンに変換。 B) ''5' AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3''': outer, forward primer (intron9に設定。) C) ''5' CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3''': reverse primer (intron 10 ): 5' outer(wild-type)のPCR, AS-PCR両方に使うようです。 94℃ 30sec, 65℃ 30sec, 72℃ 60sec x 35 cycles wild-type 409bp productがouter pairにより形成、mutantは297bpのバンドをあらわす。 文献¬e{:Beer PA. et al., MPL mutations in myeloproliferative disorders: analysis of the PT-1 coort. Blood 2008; 112: 141-9};によれば&color(red){''JAK2 V617F-''};&color(blue){''negative ET''};&color(red){''patientsの8.5%, JAK2 V617F-}; &color(blue){''negative PMF''};&color(red){''の10%にMPL W515の変異が検出されている''};。''PVでは0%であった''。 ''関連ページ'' > [[MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)]] > [[Essential thromobocythemia]] **''JAK2, MPLの異常がみられないMPNにおけるエピジェネティック制御因子異常'' [#u48ac740] &color(blue){''TET2 and ASXL1''}; pathogenic mutations are found'' in 8% of MPN lacking JAK2 and MPL mutations'', whereas IDH1, IDH2, and c-CBL mutations are not detected in this subset of patients.¬e{:Marti'nez-Avile's L, et al., TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Ann Hematol. 2012 Apr;91(4):533-41. doi: 10.1007/s00277-011-1330-0. Epub 2011 Sep 9.}; *CARL exon9 の欠失挿入変異：JAK2, MPL変異のないMPNに認められる遺伝子変異 [#e2906c5f] ''CALR''：[[calreticulin:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/811]]~ also known as: RO; CRT; SSA; cC1qR; HEL-S-99n~ Location: 19q13.3-p13.2, 9 exons~ OMIM myelofibrosis http://omim.org/entry/254450 thrombocythemia 1 http://omim.org/entry/187950 ~ carleticulin(CALR) http://omim.org/entry/109091 #br #ref(CALRmut-ET-PMF.jpg,around,right,80%) ''essential thrombocytemia(ET), myelofibrosis (MF)''ではJAK2変異, MPL変異がおのおの50-60%, 5-10%に認められる。 両方の変異が認められない30-45%の症例には特異な遺伝子異常は検出されていなかった。~ JAK, MPL変異のないMF 6例にwhole exome sequencingを行い全例にcalreticulin(CALR)をコードする''CALR遺伝子のexon9に挿入, 欠失の体細胞変異''を認めた。¬e{Klampfl:Klampfl T. et al, Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasm N Engl J Med 2013; 369(25): 2379-2390 supplement+}; -1107例のMPNを調査。&color(red){''polycytemia vela (PV)にはCALRの変異なし''};. JAK2/MPL変異のないETでは67%, MFでは88％にCALR変異が検出された。 #br -36種類の挿入, 欠失パターンすべてが, 同じ変異reding frameへフレームシフトを起し,&color(#e2041b){''新しいC末端ペプチドをもつmutant calreticulinを産生する''};(右図) -このC-terminusタンパク質をターゲットとする[[''CALR変異タンパク抗体'':http://www.cosmobio.co.jp/product/detail/mutated-calr-antibodies-dnv.asp?entry_id=15895]]が市販されている. #br -CALRの最も多い欠失変異はin vitroで''cytokineに依存しないSTAT5活性化による成長''をうながす。その機序は不明である。--->[[MPLとの関係について下記参照>#f8afaa67]] #br -&color(red){CALR変異症例はJAK2変異症例に比べ血栓症はすくなく長期に生存可能};である。 #br -すべてのCALR変異は&color(red){CALR遺伝子exon9に集中し一様にC末端酸性ドメイン, 多数のカルシウム結合サイトおよびKDELシークエンスのほとんどを消失することになる。この変異はMPNの腫瘍形成初期におこるとされる};¬e{Nangalia:Nangalia J, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2391-405. PMID:24325359};。 #br -マクロファージが介在する免疫回避, 小胞体ストレス反応(unfolded protein reaction:UPR)の活性化, カルシウムシグナルなどにかかわるCALRの役割と腫瘍が関係していると考えられる。 #clear #ref(CALRmutationJPG.jpg,around,right,80%) CALR(calreticulin)は高度に保存された, 多機能な''endoplasmic reticulum(ER)タンパク質''である。ER内ではカルシウム恒常性に不可欠な役割とタンパク質折りたたみに働いている。 ERの外では, 細胞質と膜表面に存在し, インテグリンが仲介する細胞接着, 遺伝子の核輸送, プログラムされた細胞除去, 免疫的細胞死を制御している。 CALRは''特異な機能をもつ３つのドメインより構成される''。&color(red){''N, Pドメイン''};は主として''タンパク質シャペロン機能''に関与している。 >シャペロン（chaperone）とは、他のタンパク質分子が正しい折りたたみ（フォールディング）をして機能を獲得するのを助けるタンパク質の総称。分子シャペロン（molecular chaperone）、タンパク質シャペロンともいう。 一方&color(blue){''Cドメイン''};は主として''endoplasmic reticulum(小胞体)内のカルシウム調節''にかかわっている。 さらにCドメインは&color(red){''KDELタンパクシークエンス''};''を含み, 小胞体からのタンパク質分泌''に関係している。 #clear #ref(MF-PMFmutation01.jpg,around,75%) primary myelofibrosis(PMF), essential thrombosis(ET)のgeneticな異常所見¬e{:Tefferi A, et al: CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia advance online publication 21 January 2014; doi: 10.1038/leu.2014.3}; ¬e{Klampfl:Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al: Somatic mutation of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369:2379-2390a};¬e{Nangalia:Nangalia J,et al: Somatic CALR mutation in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369:2391-2405}; ¬e{:Rumi E,et al: JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood 2014;123 (10):1544-1551}; ¬e{:Rotunno G, et al: Impact of Calreticulin Mutations on Clinical and Hematological Phenotype and Outcome in Essential Thrombocythemia. Blood 2014;123(10):1552-1555}; ¬e{:Lundberg P, et al: Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood 2014; 123(14):2220-2228}; フィラデルフィア染色体陰性のMPN（ETとPMF）で最多の遺伝学的異常はJAK2V617Fで症例の50-60%に検出され診断マーカになる。 MPL遺伝子異常はさらに4-10%のETとPMF症例に認められる。CALRのexon9, 体細胞異常（挿入/欠失）はJAK2V617Fについで二番目に多いET, PMFの遺伝子異常である。JAK2, MPLがwild typeのET, PMFにおいて, 50-90%の例に検出され, &color(red){''重要なことはpolycytemia veraにはCALR遺伝子変異は見つからないこと''};。 と記載したら、calreticulin mutationを示す, JAK2V617F(-), MPL(-)のPVが報告されました。¬e{:Broseus J, et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Oct 10. pii: blood-2014-06-583161. [Epub ahead of print]PMID:25305205}; &color(red){''polycythemia vera(PV)症例の末梢血顆粒球にCALR遺伝子変異 del52bpが認められ, BFU-Eにも同様の変異が検出された''};との報告です。 このようにCALR変異はET, PMFの診断に重要な分子マーカであり, 予後においても重要な因子である。PMFではCALR変異があると良好な予後を示す。''triple-negative (JAK2-, MPL-, CALR-)の症例はhigh-riskケースである。''-->[[triple-negtive ETの新しい遺伝子変異を参照>MPL proto-oncogene, thrombopoietin receptor (MPL)#c22d5725]] ETにおいては, CALR変異の予後に与える影響はまだ確定していない。しかし, JAK2,MPL変異のケースと比較して, &color(blue){''血栓症のリスクは低い''};とされる。 CALR変異はET,PMFのほかRARS-Tにも低頻度に認められている. (3/24, 12.5%) ¬e{: #clear #br #br #ref(DiagnosisET-PMF.jpg,around,right,80%) ***JAK2V617FのPCRによるスクリーニング [#r67a8e8e] >JAK2V617F allele-specific PCR¬e{:Baxter E et al., Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365 March19: 1054-1061}; --Fsp(allele-specific forward primer):5'AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT 3'--203bp band --Fic(internal control forward primer):5'ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG 3'--364bp internal control band --R(reverse primer): 5'CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA 3' >95℃ Xmin(Hot start Taqの活性化で, Taqにより異なる) >94℃ 30sec~ 58℃ 30sec~ 72℃ 45sec 35cycles >72℃ 5min - 4℃ soak #clear ***MPLW515L変異のPCRによるスクリーニング [#wefe101b] >MPL-W515L allele-specific PCR primer¬e{Xu:Xu W et al., MPL W515L mutation in Chinese patients with myeloproliferative diseases. Leukemia & Lymphoma 2008; 49(5):955-958}; >MPL specific primer(AS-PCR forward primer): 5'CCTGCTGCTGCTGAGGTTGC 3' --MPL intron f primer: 5'AGTAGGGGCTGGCTGGAT 3' --MPL intron r primer: 5'CTAGTCGCCGAGGTGAGC 3' >internal control 409bp, mutant band 279bp. 2つのforward primersを加えてPCR. mutantがあれば2本のバンドが出る。 >94℃ 30sec~ 65℃ 30sec~ 72℃ 1 min x 35cycle ***CALR exon9 mutation のPCR, sanger sequencing [#x99194f1] #ref(CALR-protein-structure.jpg,around,right,100%) >CALR exon9 sequencing primer¬e{Nangalia:Nangalia J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2391-405.}; --exon9f: 5'ACAACTTCCTCATCACCAACG 3' --exon9r: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG >''touch down PCR''~ 1. 95℃ X minでTaqを活性化 >2. 94℃ 30 sec, 67℃ 30 sec (-1.0℃/cycle), 72℃ 30 sec x 10cycle >3. 94℃ 30 sec, 57℃ 30 sec, 72℃ 30 sec x 29 cycle >4. 72℃ 10 min, 4℃ soak >CALR exon9 mutation--> ''high-resolution melting analysisによる同定''の論文¬e{:Bilbao-Sieyro C et al. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations.PLoS One. 2014 Jul 28;9(7):e103511. doi: 10.1371/journal.pone.0103511. eCollection 2014.};¬e{:Lim KH et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clin Chim Acta. 2014 Nov 15;440C:133-139. doi: 10.1016/j.cca.2014.11.011. [Epub ahead of print]}; ***'''CALR'''と'''MPL''' [#f8afaa67] '''''CALR'''''遺伝子変異は50種類以上同定されている.すべての変異がCドメインをコードするC-terminusのexon9の特定の領域に見つかる。&color(#e2041b){変異によってフレームシフトをおこし36個のアミノ酸からなる共通の変異型タンパクを生じる. 変異タンパクではC末端の荷電が陰性から陽性に変化する};。¬e{Klampfl:Klampfl T,et al., Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2013 Dec 19;369(25):2379-90.}; #ref(CALR-bind-to-cMPL.jpg,around,right,100%) ''Araki M, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms Blood 2016; 127(10): 1307-1316 Fig.4 A-C'' CALRのNドメインがないとC-MPLへの結合はなくなる。Nドメインだけだとかなり結合する。Pドメインをなくすと非常に結合能が高まる。(CALRはより強くc-MPLへ結合するようになる。). TPOがなくてもautonomous growthがおこるのはfull lengthのIns5のみである。このことから･･･ 1) c-MPLへ変異CALRが結合するにはfull length, すべてのパーツ(ドメイン)が必要である。 2) PドメインはNドメインへのc-MPL結合に抑制的に働いている。野生型のCALRではPドメインの抑制作用によりc-MPLへダイレクトに結合することはほとんどない。 3) 変異CALRでは, あらたにできたC末端側, 陽性荷電チャージ部分がPドメインの抑制作用をさらに抑制している。このためc-MPLとCALRの結合が増強される. CALRはerythropoietin receptorと結合するが(Araki M, et al. supplemental data),活性化できないことから(Araki M, et al. Figure 1D, Chachoua I et al. Figure 1B) PVの原因変異とはなり得ない。 -BloodにCALR変異をもつPVの報告が1例ある¬e{:Broseus J et al., Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood. 2014 Dec 18;124(26):3964-6.};が、これはどうなるのかしらん //--CALR変異はマクロファージによる貪食を回避するようになる。がんでは細胞膜上のCALRが増加しており, CALR mRNAの発現は予後不良と関連している。細胞表面のCALRはpro-phagocytic signalとして機能し, 傷んだ細胞の除去を促進する。細胞表面CALRによるpro-phagocytic機能による細胞除去はantiphagocytic signalであるCD47の過剰発現により抑制されバランスを保っている。((Chao MP, et al. Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci Transl Med. 2010 Dec 22;2(63):63ra94. doi: 10.1126/scitranslmed.3001375.PMID:21178137))((Gardai SJ, et al. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 2005 Oct 21;123(2):321-34.PMID:16239148)) //--MPNでは, CALR変異はER retention sequenceであるKDELを失うことにより, 細胞表面への発現を妨害する。CALR変異をもつ最初のMPN症例では, 細胞質と細胞膜の混在する異常な局在(())が報告されたが, より多くの検討例が必要と考えられる。 //-CALR変異は小胞体ストレス反応(UPR)を妨害し, 競合的な成長が有利になる。ERストレスに応答してUPRは活性化され, ERタンパク質の折りたたみシャペロンを活性化することでタンパク質の翻訳を停止し, 異常な細胞増殖を防いでいると考えられる。 //--UPRの摂動perturbationは, 実際にヒトのがんに関与している(()) //--変異はCALRタンパクのERでのシャペロン機能を害し, 恒常的なUPR応答を妨害することになり細胞の過剰増殖をきたす。 //>perturbation~ //天文学の用語で、ある天体とその母天体（例えば恒星と惑星、または惑星と衛星）の作る系に対し、外部の物体との重力作用によって、その軌道が乱されること。数学，物理学，天文学の問題において，主要部分は正確に解けるが，これに小さい付加項が加わった全体の問題が正確には解けない場合がある。主要部分に付加項による小さい補正が加わったものとみなして，全体の問題を近似的に解く場合に，付加項を摂動といい，その解法を摂動論という. //-変異CALRはJAK2V617Fと同様に, 異常シグナル伝達因子として働き, STATを活性化する。 *** ALL CALR mutationに対する抗体 [#cc3f4153] 川崎医科大学 藤原英世先生からご教示いただきました(2019/3月). (注; この抗体をお勧めしているわけではありません. また, research use onlyです.) ''dianova社 Mouse monoclonal antibody(CAL2) Against All CALRETICULIN(CALR) Mutations''~ 変異CALR C-neoterminusへの抗体. -川崎医科大学附属病院での検討では、希釈倍率20倍、pH6で20分の熱賦活. (Leica Bond Ⅲ)。 -希釈倍率が高くないため, すぐに抗体を消費してしまう. -巨核球の細胞質および一部の顆粒球の細胞質のみ、しかも変異症例に限ってしか 陽性にならない -controlでの評価がなかなかできないのが問題点. 過去に出ている論文でも、その点については言及されていないようです。 -ごく少数ですが、偽陰性症例あり. (順天堂大の荒木先生が自験例でいくつかあったと、2017年の血液学会で言及されていた. -実際に所見を記載する場合、藤原先生は, &color(crimson){''陽性であった場合のみ変異の可能性が示唆される''};という文言を入れるようにされている.
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